Fils d'un conseiller patrimonial et d'une galeriste, Stéphane Guillon est exclu de son lycée en seconde.

Alors que ses parents l'ont inscrit dans une « boîte à bac » près de la gare St Lazare, à Paris, il suit une formation de comédien, notamment les cours de théâtre de Jean Laurent Cochet.

 De 17 à 35 ans, il tourne dans une dizaine de téléfilms où il ne réussit cependant pas à percer. Sa carrière d'humoriste débute en 1990 par un premier one-man-show.

Mais c'est en tant que chroniqueur qu'il devient connu du grand public.

Il intervient en effet dans  la Grosse Emission sur Comédie En 2001/2002.

Puis, après s'être fait remarquer sur scène dans son one man show : Petites horreurs entre amis au  festival d’Avignon en 2002 puis à la main d’Or au printemps 2003 de Dieudonné.

Il rejoint Stéphane Bern à la radio dans l'équipe du Fou du roi, sur France Inter. Celui-ci lui propose de le suivre à la télévision, sur Canal +, dans son émission 20h10 pétantes, où il assure une chronique entre 2003 et 2005.

Suite à l'arrêt de l'émission, il continue sur Canal+ avec Thierry Ardisson dans Salut les Terriens à partir de 2006.. Depuis la rentrée 2008, il tient également une chronique intitulée « L'humeur de... » à 7 h 55 du lundi au mercredi dans Le Sept dix sur France Inter.

Il continue à mener en parallèle sa carrière d'humoriste sur scène, avec Liberté Surveillée, son dernier spectacle en date, ainsi que d'acteur au cinéma.

Son humour se veut noir, corrosif et sans tabou, « politiquement incorrect ».